10×單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組測序利用ONT長讀長實(shí)時(shí)測序技術(shù)結(jié)合10X技術(shù)可以直接讀取反轉(zhuǎn)錄的全長cDNA,并進(jìn)行快速分析。這樣能夠有效的獲取高質(zhì)量的單個(gè)RNA分子的全部序列,準(zhǔn)確辨別二代測序無法識(shí)別的同源異構(gòu)體 (isoform)、同源基因、超家族基因或等位基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本。
Nanopore測序借助分子通過納米孔時(shí)引起孔兩側(cè)電位差來實(shí)現(xiàn)信號(hào)檢測,而ATCG四種堿基的帶電性質(zhì)不同,因此通過電信號(hào)差異特征即可檢測出通過納米孔的堿基類型,從而實(shí)現(xiàn)測序。
細(xì)胞圖譜繪制、生物標(biāo)志物分析、腫瘤異質(zhì)性與耐藥分析、干細(xì)胞分化與潛能研究
(1). 將全血用 PBS 1:1 在錐形管中稀釋;
(2). 在稀釋的樣本上面加入等體積的 Ficoll;
(3). 1000g 離心 20min;
(4). 將位于 PBS 和 Ficoll 層間的 PBMC 轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的管中;
(5). 加入 PBS 清洗細(xì)胞;
(6). 4℃,300-400g 離心細(xì)胞懸液 4-5min,去除上清液;
(7). 用不含鈣鎂的 1X PBS + 0.04%BSA 緩沖液重懸沉淀細(xì)胞并做計(jì)數(shù)和活力分析;
(8). 重復(fù)步驟 6 后,將細(xì)胞用不含鈣鎂的 1X PBS + 0.04%BSA 緩沖液重懸至細(xì)胞濃度為 2×10^7/ml。
Singh M, Al-Eryani G, Carswell S, et al. High-throughput targeted long-read single cell sequencing reveals the clonal and transcriptional landscape of lymphocytes. Nat Commun. 2019;10(1):3120. Published 2019 Jul 16.
查看文獻(xiàn)Kevin Lebrigand, Virginie Magnone,Pascal Barbry,Rainer Waldmann.High throughput, error corrected Nanopore single cell transcriptome sequencing.November 05, 2019
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